【摘要】 目的：视神经损伤是以视网膜神经节细胞的轴突损害为主要特征，所以研究缺血性视神经病变模型以抑制视神经节细胞损伤对于人类治疗致盲性眼病具有重大意义。方法：大鼠60只，双眼分别为孟加拉玫瑰红注射实验组、孟加拉玫瑰红注射+激光实验组、激光实验组和空白对照组，用25g/L乌拉坦10mL/kg麻醉，ip。 结果：用孟加拉玫瑰红尾部注射和单纯激光的方法均不能产生视网膜缺血。用孟加拉玫瑰红诱导后，用激光的方法可以成功制作缺血性视神经病变模型，并在闪光VEP、视网膜血液供应、光镜、电镜、定量观察等方面都有相应的改变。
结论：用孟加拉玫瑰红诱导激光可成功制作缺血性视神经病变模型
【关键词】 孟加拉玫瑰红；缺血性视神经病变；VEP；激光；大鼠
Laser irradiation can successfully set up ischemic optic neuropathy models in Wister rats after induction with Bangladesh Rose
Yao Guo1, Lei Chen1, Min-Fang Wang2, Li-Min Liu1
1 Ocular Fundus Disease Center, the Affiliated First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China;2 Eye Disease Institute of Shenyang City, Shenyang 110031, Liaoning Province, China
Abstract AIM: To set up the animal models of ischemic optic neuropathy (ION) induced by Rose Bengale to find out a way inhibiting the impairments to retinal gangliocytes for the treatment of human ophthalmopathy.METHODS: Sixty Wistar rats were used for the establishment animal model and they were randomly divided into 4 groups: the Rose Bengale injected group, the combined treated group with Rose Bengale and laser, the laser treated group and the control group. Animals were anaesthetized by celiac injection with urethane 10mL/kg. RESULTS: ION model could not be set up simply by Rose Bengale injection or laser treatment. The ION model was successfully established by laser treatment after the inducement with Rose Bengale, and the pathological changes could be seen in many aspects and ways such as flash VEP, blood supply, optical microscope, electrical microscope and quantification. CONCLUSION: The ION animal model can be successfully established by the combined treatment with Rose Bengale and laser.
· KEYWORDS: Rose Bengale; ischemic optic neuropathy (ION); VEP; laser; rats
0引言
近年来，很多人注意到由于视神经前端的小血管循环障碍，发生局部缺氧而致组织水肿时，眼底可以出现视乳头水肿，过去将这种情况误认为是视乳头炎，或是脑肿瘤所致，现在认识到它是一个独特的疾病，称为缺血性视神经病变(ischemic optic neuropathy, ION)。该病是常见的急性血管性视神经病变，多见于年龄稍长者，可出现突然视力障碍。目前有年轻化的趋势。由于视神经损伤是以视网膜神经节细胞的轴突损害为主要特征，所以研究抑制视神经节细胞损伤对于人类治疗致盲性眼病具有重大意义。近年来国内外学者就视神经的再生做了很多基础研究，然而目前临床上尚缺乏使视神经再生的有效方法,如何抑制视神经损伤及使损伤后的视神经在结构与功能上再生修复，并实现形态认知等高层次视功能的重建，既是神经科学领域研究的新课题，又是临床研究的难题。
1材料和方法
1.1材料 Wistar大鼠60只，雌雄不限，清洁级，由中国医科大学实验动物中心提供：毛发色泽光亮，无脱毛，四肢和尾部无残缺，颈软无歪斜；双侧眼球等大，眼睑完整，睫毛整齐，角膜透明，双瞳孔等大等圆，虹膜血管清晰，散瞳查眼底双眼对称，无视神经萎缩，血晕良好。所有大鼠 置于同一鼠舍，温度控制在10~20℃。鼠舍每晨06∶00开灯，下午18∶00点熄灭，使大鼠保持自然生物节律。 孟加拉玫瑰红 （RB）纯度90% ，（美国sigma公司）；Coherent 多波长氪离子激光（美国）；VETS-3电生理机； SZXIZ 照相机（OLYMPUS 日本）。
1.2方法 大鼠双眼分别为孟加拉玫瑰红注射2.5mmoL/(mL·kg)实验组、孟加拉玫瑰红注射+激光75mmoL，20s实验组、激光实验组和空白对照组，用25g/L乌拉坦10mL/kg，ip。将大鼠在不同时间段分别用ip过量麻药处死，即刻摘除眼球。40g/L多聚甲醛固定30min，各浓度酒精浸泡2min脱水；二甲苯I、II 各2min透明。石蜡包埋，沿视神经矢状轴前后方位视网膜全层切片，厚5μm，HE染色，中性树胶封片。另处死即刻摘除眼球后，在显微镜下取出视网膜放入25g/L戊二醛溶液内固定。应用美国Image Proplus专业图像分析软件系统测量距视盘边缘100μm长度内视网膜内层厚度（指视网膜内界膜到外丛状层内缘的距离）。每只眼球取3张切片进行分析。同样方法在视网膜切片上计数100μm内神经节细胞层神经节细胞（RGC）数量，每只眼球取3张切片进行分析。视网膜打墨观察正常和和孟加拉玫瑰红诱导激光30min后分别于左心室注入墨汁5mL，此时大鼠心脏、全身、耳部及眼球迅速变为黑色，迅速处死动物并取出眼球，剪除角膜，去除晶状体、玻璃体，置于显微镜下观察。闪光VEP观察大鼠经激光后0，1，3，5，7d观察。麻醉后散瞳，未检查眼用不透光黑布遮盖避光。刺激器采用全视野闪光刺激。分别安放记录电极、参考电极和接地电极于枕骨粗隆突上、前额、耳部，记录电极和参考电极，电极为银-绿化阴皮肤接触电极，电极尽量与大鼠最大面积接触，电极线固定，参考电极置于。操作时白光闪耀，大鼠置于闪光刺激器内，刺激频率为2Hz，1.95cd/m2,每个时间点至少测量3次。
2结果
2.1缺血性视网膜组织学观察 正常组大鼠视网膜组织结构与人视网膜组织结构相似，内界膜清楚，神经纤维层较稀疏，水平排列较规整；RGCs呈单层排列，胞核较大，呈圆形或椭圆形，染色较淡，排列整齐；内丛状层较厚、疏松，呈较明显的网状结构；内核层由3~5层细胞构成，胞核较大，染色稍深；外丛状层明显薄于内丛状层；外核层较厚，由8~10层细胞组成，胞核较小，染色深，排列较紧密（图1A）。激光15~20s眼底后视乳头水肿，边界不清，动脉血管搏动，无血流中断现象。激光2min后眼底动脉无血流通过，静脉血流中断，似腊肠样，呈贫血状眼底，乳头周围苍白似棉絮状。激光3min后眼底：动脉闭塞，静脉呈串珠状。激光12h后:视网膜水肿减轻，内核层轻度变薄，神经纤维层扁平，RGC排列较稀疏。外核层变化不明显（图1B）。24h后:视网膜水肿基本消失，主要表现在RGCs数目减少，细胞变性，神经纤维层明显变薄，内核层排列紊乱，轻度变薄（图1C）。72h后视网膜水肿完全消退，内核层变薄，可见视网膜较长片段的 RGC消失。168h后RGC数目明显减少，神经纤维层变薄，内核层细胞排列紊乱，外核层变化不明显（图1D）。电镜下也有相应改变（图2A~H）。
2.2缺血性视神经病变定量观察 早期以水肿为主，晚期以细胞变性、萎缩及凋亡为主。正常大鼠视网膜内层平均厚度为102.4±4.2μm，缺血12h，视网膜内层厚度变为67.8±2.8μm，两者相比差异显著；正常大鼠视网膜神经节细胞密度为88.5±2.2个/mm，缺血12h后即变为43.2±3.2个/mm，两者相比差异显著。缺血24h上述变化最为明显，至缺血168h略有回升，但仍然显著低于正常组,实验组与对照组之间各时间点t检验结果P＜0.05，差异具有显著性（表1）。
2.3视网膜打墨观察 正常大鼠视网膜血液供应。图3（A~B）视网膜缺血模型血液循环经孟加拉玫瑰红诱导激光30min后视乳头水肿，边界不清，动静脉血流中断，图3（C~F）。
2.4闪光VEP 观察实验眼较对照眼潜伏期均延迟，振幅降低（图4A~D）。
3讨论
视网膜缺血性改变是在眼科非常常见[1-4]，如缺血性视神经病变、视网膜中央动、静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、青光眼等致盲性眼病，其组织学变化主要表现在视网膜厚度和神经节细胞数目的改变，早期以水肿为主，晚期以细胞变性、萎缩及凋亡为主[5-7]；功能学改变包括视力下降，视网膜电图下降等改变。缺血性视神经病变的发病机制及临床治疗一直为广大眼科界所关注。视网膜缺血性改变发生机制比较复杂，目前比较公认的学说有：（1）刺激性氨基酸学说；（2）自由基损伤学说；（3）钙离子通道学说；（4）神经保护因子学说等，针对上诉学说，研究出缺血性视神经病变模型是目前亟待解决的课题[8-10]。
常用的视网膜缺血模型有高眼压模型、血管结扎模型、光化学阻断模型和游离视网膜模型等[11-13]。我们采用的孟加拉玫瑰红诱导的激光缺血模型[14-16]，容易控制，可以通过激光时间的长短造成不同程度的视网膜缺血，且不受如眼压等其他因素影响，各项指标均相似缺血性视神经病变，通过在形态学及功能方面大量的研究已证明了此方法的可靠性和稳定性，经孟加拉玫瑰红诱导后，用激光的方法可以成功制作缺血性视神经病变模型，为进一步探讨视网膜缺血等疾病打下坚实基础。
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